DNA実験

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資料紹介

DNA実験
１、目的　制限酵素処理したDNAと未処理のDNAを用いて電気泳動を行い、その移動差を測定する。この移動差がプラスミドDNAのどのような違いに基づくものかを推定する。また、実験結果から制限酵素によりベクターがどのような作用を受けたかを調べる。
２、材料と方法
　Ⅰ制限酵素処理
　　　まずマイクロピペットを用いて、プラスミドDNAを4μℓ、10x制限酵素用バッファーを2μℓ、H2Oを13μℓ、制限酵素１μℓをマイクロチューブに入れる。プラスミドDNAはa,bの２種類。制限酵素はEcoRⅠ、PstⅠの２種類を用意した。それぞれの組み合わせにより４種類のサンプルを作った。
１…a/Ec
2…a/Ps
3…b/Ec
4…b/Ps
それぞれのサンプルは軽く撹拌して数秒程度遠心して37℃の恒温槽で1時間反応させた。反応させている間にアガロースゲルの作製を行った。
　Ⅱアガロースゲル電気泳動
　　ア、アガロースゲルの作製
　　　　0.6ｇのアガロースの入った三角フラスコに泳動バッファー50ml加えて電子レンジで温めた。約60℃になったところでゲル作成台に流し込み約30分間放置した。ゲルが固まったところで、少量のH20を注いでコームを引き抜いた。
　　イ、泳動機のセッティング
　　　　泳動機に泳動バッファー400mlを加えてゲルを入れた。泳動機と電源をリード線でつないだ。
　　ウ、サンプルの添加
　　　　Ⅰの工程で反応させておいたサンプルを取り出し、10x泳動用サンプルバッファーを2μℓずつ加えて、撹拌、遠心を行った。また、未処理のプラスミドＤＮＡ a/bを3μℓとり、水を7μℓ加えて、10ｘ泳動用サンプルバッファー2μℓを加えた。（未処理のaをa´、未処理のbをｂ´とした）
まず、分子量マーカー10μℓをゲルの穴の両端に添加した。その後、a´、a/Ec、a/Ps、b/Ec、b/Ps、b´の順に10μℓずつ添加した。
　　エ、電気泳動
　　　　全てのサンプルを添加したのち、泳動機の電圧を100Ｖに設定してスイッチを入れて約１時間泳動させた。
　　オ、ゲルの染色と観察
　　　　　発泡スチロール容器にEtBr溶液を深さ１cmほど入れ、撹拌したのち、ゲルを台からはずして液につけた。約15分間染色した後、紫外線下で観察してポラロイド写真を撮影した。
３、結果
　Ⅰ分子量マーカーを泳動したレーンで観察されるＤＮＡの各バンドの移動差を測定し、片対数のグラフ用紙にプロットした。(図Ⅰ)7700bp以下の分子量ではほぼ一直線上になった。
　Ⅱ制限処理したプラスミドDNAのレーンに見えるバンドの移動度を測定し、Ⅰで作製したグラフを利用して各バンドの分子量を推定した。（図Ⅱ）
それぞれのサンプルのレーンで見られたバンドの位置と分子量(推定)を下に示した。
サンプル泳動距離分子量 a´ 2.10cm 2100bp a/Ec 1.75cm 3090bp a/Ps 1.75cm 3090bp 2.10cm 2100bp b/Ec 1.75cm 3090bp 2.42cm 1550bp b/Ps 1.47cm 4400bp b´ 1.70cm 3250bp 　
４、考察
　Ⅰ、制限酵素処理のDNAと未処理のDNAの移動には明白な違いが現れた。プラスミドDNAのaにおいては。EcoRⅠで処理したものは泳動距離が短くなり、PstⅠ処理したものでは、泳動距離が短くなったものと、未処理のときと距離が変わらない２つのバンドが出現した。プラスミドDNAのbについては、EcoRⅠ処理し